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什么是紫外分光光度計?原理、優(yōu)勢、局限性及應用

2022-08-26

紫外-可見(jiàn)(UV-Vis)光譜是一種廣泛應用于許多科學(xué)領(lǐng)域的技術(shù),從細菌培養、藥物鑒定和核酸純度檢查和定量,到飲料行業(yè)的質(zhì)量控制和化學(xué)研究。本文將介紹UV-Vis光譜的工作原理、如何分析輸出數據、該技術(shù)的優(yōu)勢和局限性以及它的一些應用。

紫外-可見(jiàn)(UV-Vis)光譜是一種廣泛應用于許多科學(xué)領(lǐng)域的技術(shù),從細菌培養、藥物鑒定和核酸純度檢查和定量,到飲料行業(yè)的質(zhì)量控制和化學(xué)研究。本文將介紹UV-Vis光譜的工作原理、如何分析輸出數據、該技術(shù)的優(yōu)勢和局限性以及它的一些應用。


什么是紫外可見(jiàn)分光光度計?

UV-Vis光譜是一種分析技術(shù),它測量與參考或空白樣品相比樣品吸收或透射過(guò)的UV或可見(jiàn)光的離散波長(cháng)的數量。此屬性受樣品成分的影響,分析結果可能會(huì )提供有關(guān)樣品中成分和濃度的信息。由于這種光譜技術(shù)依賴(lài)于光的使用,所以讓我們首先談一談光的特性。

 

光具有與其波長(cháng)成反比的一定量的能量。因此,較短波長(cháng)的光攜帶更多的能量,而較長(cháng)波長(cháng)的光攜帶較少的能量。需要特定量的能量來(lái)將物質(zhì)中的電子提升到更高的能量狀態(tài),我們可以將其檢測為吸收。物質(zhì)中不同鍵合環(huán)境中的電子需要不同的特定能量來(lái)將電子提升到更高的能量狀態(tài)。這就是為什么在不同物質(zhì)中對不同波長(cháng)會(huì )發(fā)生光吸收的原因。人類(lèi)能夠看到一系列可見(jiàn)光,從大約380nm(我們看到的紫色)到780nm(我們看到的紅色)。紫外光的波長(cháng)比可見(jiàn)光短,約為100nm。因此,光可以通過(guò)其波長(cháng)來(lái)描述,這在UV-Vis光譜中可用于通過(guò)定位與大吸光度相對應的特定波長(cháng)來(lái)分析或識別不同的物質(zhì)(參見(jiàn)下文中UV-Vis光譜的應用部分)。

 

紫外可見(jiàn)分光光度計如何工作?

雖然UV-Vis分光光度計有許多類(lèi)型,但為了更好地了解UV-Vis分光光度計的工作原理,我們主要考慮分光光度計的主要組件,如下圖1所示。


圖1:紫外可見(jiàn)分光光度計主要組件的示意圖。

 

1、光源

作為一種基于光的技術(shù),一個(gè)能夠在很寬的波長(cháng)范圍內發(fā)射光的穩定光源是必不可少的。單個(gè)氙氣燈通常用作紫外線(xiàn)和可見(jiàn)光范圍的高強度光源。然而,與鎢燈和鹵素燈相比,氙氣燈的成本更高且穩定性較差。

 

對于使用兩個(gè)燈的儀器,鎢燈或鹵素燈通常用于可見(jiàn)光,而氘燈是紫外光的常見(jiàn)光源。由于需要兩種不同的光源來(lái)掃描紫外和可見(jiàn)波長(cháng),因此在測量過(guò)程中須切換儀器中的光源。在實(shí)踐中,這種切換通常發(fā)生在300和350nm之間的掃描范圍,其中來(lái)自?xún)蓚€(gè)光源的光發(fā)射相似,并且可以更平滑地進(jìn)行轉換。

 

2、波長(cháng)選擇

在下一步中,須從光源發(fā)出的寬波長(cháng)中選擇適合用于檢測的樣品類(lèi)型和分析物的特定波長(cháng)的光進(jìn)行樣品檢查。常用的方法包括:

 

 

3、樣品分析

無(wú)論在分光光度計中使用哪種波長(cháng)選擇器,光都會(huì )穿過(guò)樣品。對于所有分析,測量參考樣品(通常稱(chēng)為“空白樣品”)(例如裝有用于制備樣品的類(lèi)似溶劑的比色皿)是必不可少的。如果使用含有樣品的緩沖溶液進(jìn)行測量,則使用不含目標物質(zhì)的緩沖溶液作為參考。檢查細菌培養物時(shí),將使用無(wú)菌培養基作為參考。參考樣品信號隨后由儀器自動(dòng)使用,以幫助獲得分析物的真實(shí)吸光度值。

 

了解UV-Vis光譜實(shí)驗中使用的材料和條件非常重要。例如,大多數塑料比色皿不適用于紫外線(xiàn)吸收研究,因為塑料通常會(huì )吸收紫外線(xiàn)。玻璃可以充當過(guò)濾器,通常會(huì )吸收大部分UVC(100-280nm)和UVB(280-315nm)但允許一些UVA(315-400nm)通過(guò)。因此,紫外檢測需要石英樣品架,因為石英對大部分紫外光是透明的??諝庖部梢员徽J為是一種過(guò)濾器,因為波長(cháng)短于約200nm的光被空氣中的分子氧吸收。波長(cháng)小于200nm的測量需要特殊且更昂貴的設置,通常涉及充滿(mǎn)純氬氣的光學(xué)系統。色皿系統也可用于分析非常小的樣品體積,例如在DNA或RNA分析中。

 

4、檢測

光線(xiàn)穿過(guò)樣品后,檢測器用于將光線(xiàn)轉換為可讀的電子信號。通常,探測器基于光電涂層或半導體。

 

光電涂層在暴露于光噴出帶負電荷的電子。當電子被射出時(shí),會(huì )產(chǎn)生與光強成正比的電流。光電倍增管(PMT)是紫外-可見(jiàn)光譜中較常用的檢測器之一。參考下圖2,PMT基于光電效應,在曝光時(shí)首先發(fā)射電子,隨后發(fā)射的電子依次倍增以產(chǎn)生更大的電流。PMT檢測器對于檢測非常低的光強度特別有用。


當半導體暴露在光下時(shí),可以通過(guò)與光強成正比的電流。更具體地說(shuō),光電二和電荷耦合器件(CCD)是兩種常見(jiàn)的基于半導體技術(shù)的檢測器。

 

使用任何探測器產(chǎn)生電流后,信號就會(huì )被識別并輸出到計算機或屏幕上。如上圖2和下圖3顯示了紫外-可見(jiàn)分光光度計布置的一些簡(jiǎn)化示意圖。


圖2:基于比色皿的紫外-可見(jiàn)光譜系統示意圖。


圖3:色皿UV-Vis光譜系統示意圖。

 

紫外-可見(jiàn)光譜分析、吸收光譜和吸光度單位

UV-Vis光譜信息可以表示為吸光度、光密度或透射率與波長(cháng)的函數關(guān)系圖。但是,該信息通常以y軸(縱軸)上的吸光度和x軸(橫軸)上的波長(cháng)的圖形形式呈現。該圖通常稱(chēng)為吸收光譜,如下圖4所示。


圖4:從紫外-可見(jiàn)分光光度計獲取的吸收光譜圖。檢查的樣品是溶解在中性pH磷酸鹽緩沖液中的血紅蛋白。

 

根據本文前一節中介紹的紫外-可見(jiàn)分光光度計儀,可以合理地預期光強度與樣品吸收的光量定量相關(guān)。

 

吸光度(A)等于涉及的光的強度通過(guò)樣品之前的對數值(Io)通過(guò)的光的強度通過(guò)樣品(I)。I除以Io的分數也稱(chēng)為透射率(T),它表示通過(guò)樣品的光量。然而,當摩爾吸光率(ε)和路徑長(cháng)度(L)已知時(shí),比爾-朗伯定律(Beer-Lambert)通常用于在測量吸光度(A)后獲得樣品的濃度(c)。通常,ε以L(fǎng)﹒mol-1cm-1為單位表示,L以cm為單位,c以mol/L為單位表示。因此,A沒(méi)有單位。

 

有時(shí)AU用于表示任意單位或吸光度單位,但一般建議不要這樣表示。

 

如果使用一組測量的包含相同物質(zhì)的標準溶液存在線(xiàn)性關(guān)系,Beer-Lambert定律對于獲得物質(zhì)的濃度特別有用。公式1顯示了吸光度、比爾-朗伯定律、儀器中測量的光強度和透射率之間的數學(xué)關(guān)系。


公式1:此方程顯示了吸光度A、比爾-朗伯定律、儀器中測量的光強度和透射率之間的關(guān)系。

 

光密度(OD)有時(shí)會(huì )錯誤地與吸光度互換使用。OD和吸光度都測量光學(xué)組件中光強度損失的量,但OD考慮了光散射的損失,而吸光度則沒(méi)有。如果測量中存在非常少的光散射,則可以使用吸光度直接近似估計OD,并且可以使用Beer-Lambert定律。

 

在測量過(guò)程中了解實(shí)驗條件很重要。用于1cm路徑長(cháng)度的比色皿是標準的并且是常見(jiàn)的。有時(shí),可用于檢查的樣本非常少,因此需要小至1毫米的較短路徑長(cháng)度。如果需要定量,吸光度值應保持在1以下,并且保持在儀器的動(dòng)態(tài)范圍內。這是因為吸光度為1意味著(zhù)樣品吸收了90%的入射光,或者等效地表述為10%的入射光透過(guò)樣品。由于到達檢測器的光很少,一些紫外-可見(jiàn)分光光度計不夠靈敏,無(wú)法可靠地量化少量光。解決這個(gè)問(wèn)題的兩個(gè)簡(jiǎn)單可能的解決方案是稀釋樣品或減少路徑長(cháng)度。

 

如上所述,使用“空白”參考溶液記錄基線(xiàn)光譜是必不可少的。如果儀器在各方面都好,那么基線(xiàn)對每個(gè)檢測波長(cháng)的吸光度都為零。然而,在實(shí)際情況下,基線(xiàn)光譜通常會(huì )有一些非常小的正負吸光度值。為實(shí)現實(shí)踐,軟件通常會(huì )自動(dòng)從每個(gè)光波長(cháng)的樣品吸光度值中減去這些小的吸光度值,以獲得真實(shí)的吸光度值。

 

根據分析的目的,可能需要構建校準曲線(xiàn)。建立校準曲線(xiàn)需要一些數據分析和額外的工作,但根據吸光度測量值準確確定樣品中特定物質(zhì)的濃度非常有用。然而,在許多情況下不需要校準曲線(xiàn),包括用于細菌培養的OD測量、在特定波長(cháng)處獲取吸光度比以評估核酸純度或識別某些藥物。

 

在紫外可見(jiàn)分光光度計中,選擇對應于目標物質(zhì)大吸光度的波長(cháng)進(jìn)行分析。這種選擇確保了大的靈敏度,因為對于特定的分析物濃度可以獲得大的響應。下圖5提供了Food Green 3(一種染料)的UV-Vis吸收光譜示例和使用標準溶液的相應校準曲線(xiàn)。請注意,Food Green 3染料中存在兩個(gè)大吸收峰,一個(gè)較小的大吸收峰位于435nm,在619nm處有一個(gè)更強烈的大吸收峰。為了在計算未知濃度的Food Green 3時(shí)獲得大靈敏度,使用619nm處的大吸光度峰進(jìn)行分析。通過(guò)稀釋溶液,進(jìn)行吸光度測量,然后將它們繪制在吸光度與濃度的關(guān)系圖上,以建立濃度和吸光度之間的數值關(guān)系,從而制備了一系列已知濃度的標準溶液。使用小二乘線(xiàn)性回歸方程創(chuàng )建校準曲線(xiàn)。數據點(diǎn)越接近直線(xiàn),擬合越好。直線(xiàn)方程中的y截距設置為零以表示當不存在染料時(shí)沒(méi)有吸光度。下圖5中所示的方程用于根據測得的吸光度(變量y)計算未知樣品中Food Green 3(變量x)的濃度。


圖5:左圖顯示了從樣品中的Food Green 3的UV-Vis光譜。右圖顯示的校準曲線(xiàn),使用小二乘線(xiàn)性回歸方程從Food Green 3的標準稀釋溶液中得出的。

 

對于數據分析,吸光度與濃度的關(guān)系圖可以表明系統在構建校準曲線(xiàn)時(shí)的靈敏度。當使用線(xiàn)性小二乘回歸方程時(shí),擬合線(xiàn)的斜率表示靈敏度。如果斜率更陡,則靈敏度更高。靈敏度是區分樣品濃度微小差異的能力。根據 Beer-Lambert 定律,靈敏度可以部分地由摩爾吸收率ε 表示。事先了解ε值(如果有)有助于確定所需樣品的濃度,尤其是在樣品有限或昂貴的情況下。

 

為了可靠性和實(shí)踐,應重復紫外-可見(jiàn)光譜實(shí)驗和讀數。在重復檢查樣品時(shí),通常至少進(jìn)行3次重復試驗是常見(jiàn)的,但在某些工作領(lǐng)域需要進(jìn)行更多次重復試驗。計算出的數量,例如未知樣品的濃度,通常報告還應該帶有標準偏差的平均值??芍噩F的結果對于確保準確、高質(zhì)量的測量至關(guān)重要。標準偏差、相對標準偏差或變異系數有助于確定系統和測量的準確度,較低的偏差或變化表明較高的精度和可靠性水平。

 

紫外可見(jiàn)分光光度計的優(yōu)勢和局限性

沒(méi)有一種技術(shù)是好的,紫外-可見(jiàn)光譜也不例外。但是,該技術(shù)確實(shí)具有以下的一些主要優(yōu)勢,使其應用廣泛。

 

 

雖然這種技術(shù)的優(yōu)勢看起來(lái)非常明顯,但也存在一定的弱點(diǎn):

 

 

紫外可見(jiàn)分光光度計的應用 

UV-Vis已發(fā)現其適用于許多用途和情況,包括但不限于:

 

1、DNA和RNA分析

快速驗證RNA和DNA的純度和濃度是一種特別廣泛的應用。下表1中給出了分析中使用的波長(cháng)及其指示的摘要。在制備DNA或RNA樣品時(shí),例如用于測序等下游應用時(shí),通常重要的是要驗證其中一個(gè)樣品沒(méi)有被其他,或從分離過(guò)程中攜帶的蛋白質(zhì)或化學(xué)物質(zhì)。


260nm/280nm吸光度(260/280)比值可用于揭示核酸樣品中可能存在的污染,如下表2所示。純DNA的260/280比值通常為1.8,而純RNA的比值通常為2.0 .純DNA的260/280比值低于RNA,因為在RNA中被尿嘧啶取代的胸腺嘧啶的260/280比值低于尿嘧啶。由于280nm處的吸光度較高,被蛋白質(zhì)污染的樣品會(huì )降低260/280比值。

用于吸光度分析的波長(cháng)(nm)

這個(gè)波長(cháng)的紫外吸光度表明存在什么物質(zhì)?

是什么導致此波長(cháng)的紫外線(xiàn)吸收?

230

蛋白質(zhì)

蛋白質(zhì)形狀

260

DNA和RNA

腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶

280

蛋白質(zhì)

主要是色氨酸和酪氨酸

表1:確定260/280和260/230吸光度比值時(shí)有用的UV吸光度匯總。




吸光度比

典型值

260/280

純DNA的典型吸光度比為1.8

純RNA典型的吸光度比為2.0

260/230

吸光度比不同;2.15至2.50典型值用于RNA和DNA

表2:DNA和RNA分析的預期紫外線(xiàn)吸光度比值總結。


260nm/230nm吸光度(260/230)比率也可用于檢查DNA和RNA樣品的純度,并可揭示蛋白質(zhì)或化學(xué)污染。蛋白質(zhì)可以吸收230nm的光,從而降低260/230比率并指示DNA和RNA樣品中的蛋白質(zhì)污染。硫氰酸胍和異硫氰酸胍是純化核酸中常用的兩種化合物,在230nm處有強烈吸收,這也會(huì )降低260/230的吸光度比值。


2、藥物分析

UV-Vis光譜常見(jiàn)的用途之一是在制藥行業(yè)。使用數學(xué)導數處理UV-Vis光譜允許解析原始光譜中的重疊吸收峰以識別單個(gè)藥物化合物。例如,苯佐卡因(一種局部麻醉劑)和金霉素(一種抗生)可以通過(guò)將一個(gè)數學(xué)導數應用于吸光度光譜,同時(shí)在商業(yè)獸用粉末制劑中進(jìn)行鑒定。通過(guò)為每種化合物構建校準函數,可以在微克/毫升的濃度范圍內同時(shí)定量這兩種物質(zhì)。


3、細菌培養

紫外可見(jiàn)分光光度計常用于細菌培養。OD測量通常使用600nm的波長(cháng)快速進(jìn)行,以估計細胞濃度并跟蹤生長(cháng)。600nm是常用和優(yōu)選的,因為它們在其中生長(cháng)的細菌培養基的光學(xué)特性以及避免在需要繼續實(shí)驗的情況下?lián)p壞細胞。


4、飲料分析

識別飲料中的特定化合物是紫外可見(jiàn)光譜的另一個(gè)常見(jiàn)應用。含量須在一定的法律限制內,紫外線(xiàn)可以促進(jìn)量化。某些類(lèi)別的有色物質(zhì),例如在藍莓、覆盆子、黑莓和櫻桃中發(fā)現的花青素,可以通過(guò)匹配它們在葡萄酒中的已知峰值吸收波長(cháng)來(lái)輕松識別,以便使用紫外可見(jiàn)吸收進(jìn)行質(zhì)量控制。


5、其他應用

這種技術(shù)也可用于許多其他行業(yè)。例如,測量顏色指數可用于監控變壓器油,作為確保電力輸送的預防措施。測量血紅蛋白的吸光度以確定血紅蛋白濃度可用于癌癥研究。在廢水處理中,UV-Vis光譜可用于動(dòng)力學(xué)和監測研究,通過(guò)比較一段時(shí)間內的光譜,確保某些染料或染料副產(chǎn)品已被正確去除。


UV-Vis光譜在一些更專(zhuān)業(yè)的研究中也非常有用。在對應于吸收峰的波長(cháng)的跟蹤變化是在檢查特定結構蛋白改變有用和在確定電池組合物。峰值吸收波長(cháng)的偏移也可用于更現代的應用,例如非常小的納米粒子的表征。這種技術(shù)的應用多種多樣,而且似乎無(wú)窮無(wú)盡。